😶 프로바이오틱스 소재의 in vitro 세포 독성 평가을 하려했을 때, 연구소의 SOP(표준작업지침서)에 따라세포주 실험 전 사전 절차가 필요했다.사용할 세포주를 반드시 RCB (Research Cell Bank)에 등록한 후 사용하는데이 과정에서 필수적으로 수행해야했던 ㅡ Mycoplasma 검출 테스트 ㅡ 간만에 PCR과전기영동할 생각하니 심장이 두근두근:D
출처: 인트론바이오테크놀로지 홈페이지
😶 매뉴얼 Overview를 살펴보니, PCR용 Template 준비 과정 I. genomic DNA method, II. Cell boiling method 로 두 가지 방법이 있었고, 이 중 두번째 Cell boiling method로 실험을 진행했었다.
프로토콜II - Cell boiling method
1. 세포 준비 | Cell Preparation 2. 세포 회수 및 세척 | Cell Harvesting & Washing 3. 세포 파쇄용 샘플 준비 | Sample Preparation for Lysis 4. 세포열처리 & template 확보 | Heat Treatment & Template Extraction
1. 세포 준비 | Cell Preparation
• Prepare cell suspensions from the test cell culture in a 1.5 ml tube. → 검사 대상 세포 배양액에서 1.5 mL 튜브에 세포 현탁액을 준비한다. • Count cell numbers by general counting methods (e.g., hemocytometer or automatic cell counter). → Hemocytometer 또는 자동세포카운터 등 일반적인 방법으로 세포 수를 계수한다. • At least 5 × 10⁴ cells are required per test. → 각 실험에 최소 5 × 10⁴ cells 이상 필요하다.
NOTE Strong mycoplasma infections can be detected from as few as 10–100 cells, while weak infections may require 5,000–50,000 cells. → 강한 감염은 10–100 cells로도 검출 가능하며, 약한 감염은 5,000–50,000 cells가 필요하다. You can dilute the template depending on the suspected infection level. → 감염 정도에 따라 template를 희석 가능하다. We recommend preparing serial dilutions of the straight supernatant for optimal PCR results. → 최적의 결과를 위해 원액 시료(straight supernatant)를 연속 희석한 뒤 PCR을 수행하는 것을 추천!
2. 세포 회수 및 세척 | Cell Harvesting & Washing
• Transfer the counted cells to a 1.5 ml tube. Spin in a microcentrifuge for 10–15 seconds and carefully decant the supernatant. → 계수한 세포를 1.5 mL 튜브에 옮기고, 센도리😉로 10–15초간 스핀 후 상층액을 제거한다. • Resuspend the cells in 1 mL of sterile PBS or DPBS. → 멸균된 PBS 또는 DPBS 1 mL에 세포를 재현탁한다. • Spin the tube again for 10–15 seconds and decant the supernatant. → 다시 10–15초간 스핀한 뒤 상층액을 제거한다. [Optional] Repeat the wash step once more if needed. → [선택] 필요할 경우 세척을 한 번 더 반복할 수 있다.
3. 세포 파쇄용 샘플 준비 | Sample Preparation for Lysis
• Resuspend the cell pellets in 100 μl of sterile PBS or DPBS. → 세포 펠릿을 멸균된 PBS 또는 DPBS 100 μL에 재현탁한다. NOTE For the best results, PBS is preferred over Tris (10 mM, pH 8.5), TE buffer, or autoclaved distilled water. → 최상의 결과를 위해 Tris(10 mM, pH 8.5), TE 버퍼, autoclaved DW보다 PBS 사용을 권장한다.
• Heat the sample at 95ºC for 10 minutes. → 샘플을 95℃에서 10분간 가열한다. • Vortex the tube for 5–10 seconds. → 튜브를 5–10초간 vortex 처리한다. • Centrifuge at 13,000 rpm for 2 minutes at room temperature. → 실온에서 13,000 rpm으로 2분간 원심분리한다. • Transfer an aliquot of the heated supernatant to a new tube. This will be used as the template for PCR. → 가열된 상층액 일부를 새로운 튜브로 옮기며, 이 상층액이 PCR의 template로 사용된다.
🍯 TIP 경험상, 이런 비정제 샘플은 PCR 단계에 바로 들어가는게 좋았다. 전기영동을 내렸을 때 Band Quality가 확실히 좋았는데 ㅡ 만에 하나 실험을 도중에 못한다..? 이런 땐 바로 - 80 ºC 딥프리저 행 필수🚅
PCR TEST
사전 준비 사항 | Preparation Notes
• Leave it at 4ºC or room temperature for thawing. Do not leave it at room temperature more than 1 hour. → 4 ºC 또는 실온에서 해동하되, 실온 방치는 1시간을 넘기지 않도록 한다.
• Use clean, disposable gloves when performing the assay and make sure that the work area is clean prior to starting the assay setup. → 실험 시 일회용 장갑을 착용하고, 실험 시작 전 작업대를 청결하게 유지한다.
• All procedures must be done on a clean bench that should be cleaned with 70% alcohol or 10% household bleach (Na-hypochlorite) after use. The samples used should be kept separate. If discarded, it is considered to be a biological hazardous substance after high-pressure sterilization and discarded. → 모든 과정은 클린벤치에서 수행하며, 사용 후 70% 에탄올 또는 가정용 락스(차아염소산나트륨)로 소독한다. 사용된 샘플은 다른 시료와 분리 보관하고, 폐기 시 고압멸균 후 생물학적 유해물로 처리한다.
실험 절차 | Assay Procedure
1. Prepare appropriate number of e-Myco™ Mycoplasma PCR Premix tubes. → 실험에 필요한 수의 e-Myco™ PCR 프리믹스 튜브를 준비한다. (양성/음성 대조 포함, 샘플 수 × 2로 계산)
2. Add 10 μl of DNase/RNase-free water into the RT-PCR Pre-mixture tube. → 각 RT-PCR 프리믹스 튜브에 DNase/RNase-free water 10 μL를 넣는다.
3. Add 10 μl of DNA sample to each of strip tubes. → 각 스트립 튜브에 DNA 샘플 10 μL를 넣는다.
4. For positive and negative confirmation, use 1 μl of positive control or DNase/RNase-free water as a test sample. Then, adjust the reaction volume to 20 μL. → 양성/음성 대조군에는 positive control/DNase/RNase-free water를 각각 1 μL 넣고, 최종 반응 부피가 20 μ L가 되도록 조정한다.
5. Dissolve the blue pellet by pipetting or vortexing. → 파란색 펠릿은 피펫팅 또는 vortex로 녹인다. 🧺 The pellet is easily dissolved, by letting the mixture stand at R.T. for 1–2 minutes after adding water. → 물 첨가 후 실온에서 1–2분 두면 쉽게 녹는다👍
6. Perform PCR reaction of samples as the below process using thermal cycler. → 아래 조건에 따라 thermal cycler로 PCR을 수행한다. 7. For analysis by electrophoresis, use 5 μl of each tube. → 전기영동 분석 시, 각 튜브에서 5 μL를 사용한다.
8. PCR products should be discarded after UV irradiation (10 min) to prevent carry-over contamination. → PCR 산물은 교차오염 방지를 위해 UV(365nm)로 10분 조사 후 폐기한다.
기술 정보 | Technical Information
📌 증폭산물 크기 정보| PCR Product Size Information
The size of DNA fragments that are amplified by the specific primers in this kit is about 270 bp. → 이 키트의 특이적인 프라이머에 의해 증폭되는 DNA 조각의 크기는 약 270 bp이다.
However, the sizes of PCR product differ slightly from species to species (268 bp ~ 277 bp). → 다만, 종(species)에 따라 PCR 산물의 크기는 차이가 있을수도 268 bp ~ 277 bp 범위 내 변동될 수 있다.
📌 부가 정보 | Additional Informations
*** PCR 관련 ❓ Under optimal conditions, templates derived from supernatants of an infected cell culture will yield a maximum signal in the PCR reaction, whereas an uninfected cell line will yield no PCR products. → 감염된 세포 배양 상등액으로부터 얻은 template는 최대 PCR 신호를 나타내며, 반대로 비감염 세포주는 PCR 산물이 나타나지 않는다.
Undoubtedly, there will be variations in cell numbers, infection amount, and templates that may contribute to signal differences in your experiments. → 실험마다 ㅡ 세포 수, 감염 정도, template 양 등에 따라 PCR 신호 강도의 차이가 발생할 수 있다.
*** 샘플 준비 관련 ❓ It is recommended that you use cultured cells that have cultivated for 3–6 days after subculturing as a sample for mycoplasma detection. → 마이코플라즈마 검출 시에는 계대 후 3~6일간 배양한 세포를 사용하는 것이 권장된다.
You may not detect mycoplasma infection efficiently when you use cells that are not or shortly cultivated. → 계대하지 않았거나 배양 기간이 짧은 세포에서는 감염 여부를 효율적으로 검출하지 못할 수 있다.
*** PCR 민감도 & Template 준비 관련 ❓ Strong mycoplasma infections are detected in as little as 10–100 cell equivalents, while weak infections require cell equivalents from the 5,000–50,000 range. → 강한 감염은 10~100 cell 수준에서도 검출되며, 약한 감염은 5,000~50,000 cell 수준이 필요하다.
So, we recommend that you plan various cell numbers in preparing PCR templates from the cultured cells by using the boiling method. → 따라서, boiling method로 template를 준비할 때는 여러 세포 수 조건을 고려하여 실험 계획을 세우는 것이 좋다. 출처: e-Myco™ VALiD Mycoplasma PCR Detection Kit 매뉴얼. M. fermentans에 감염된 K562 세포의 마이코플라즈마를 검출 결과
Lane M – 100 bp DNA Marker, Lane 1 – 2 × 10⁵ cells, Lane 2 – 1 × 10⁵ cells, Lane 3 – 5 × 10⁴ cells Lane 4 – 2.5 × 10⁴ cells, Lane 5 – 1.25 × 10⁴ cells, Lane 6 – 6.25 × 10³ cells, Lane 7 – 3.125 × 10³ cells, Lane 8 – 1.56 × 10³ cells, Lane 9 – 780 cells, Lane 10 – 390 cells, Lane 11 – 190 cells, Lane 12 – 96 cells, Lane 13 – 48 cells, Lane 14 – 24 cells, Lane 15 – 1 cell, Lane IC – Internal Control; 감염된 K562 세포 1 cell 부터 2 × 10⁵ cells 까지 PCR template로 사용
Outro: 또 다른, 적용 분야는?
🙄또 궁금한건 못 참지ㅡ 또 다른, 적용 분야도 찾아보았다.
📌적용 분야| Application Fields
✅ 세포 기반 의약품의 전/중/후 공정 Mycoplasma 오염 모니터링 → 바이오의약품, 세포치료제, 백신 등 제조 시 공정별 무균성 확인에 사용 ✅ 세포 치료제 개발 및 제조용 세포주 오염 관리 → 장기간 배양, 다단계 공정에 따른 세포주 청정성 관리에 필수적 ✅ 연구소 및 GMP 시설 내 정기적 마이코플라즈마 테스트 → 실험실, 바이오 기업, CMO 등 품질 보증(QA) 목적의 정기 점검 용도
📌 국내외 규제 및 가이드라인 관련
: 국내 「세포치료제 제조 및 품질관리기준 가이드라인」 및 미국USP , 유럽EP 약전의 Mycoplasma PCR 부정시험
* 출처: 세포치료제 제조 및 품질관리기준 가이드라인(2017)
📩 Take-HomeMessage Mycoplasma 시험! 연구소 세포주 오염 관리, GMP 수준 세포기반 제품 공정 품질 관리, 국내외 규제기관 허가 대응 목적 으로 활용되고 있는 시험이다.
